一、背景介紹
生物打印旨在使用特定的活細(xì)胞制造生物活性組織或器官，用于治療疾病或測試方式 。人們在設(shè)計細(xì)胞類型、細(xì)胞材料生態(tài)位和再生方法方面做出了廣泛的努力。然而，直接打印載有細(xì)胞的生物墨水以在體外重建功能和結(jié)構(gòu)完整的器官或組織可能是一項挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)上，采用基于擠出的生物打印，其中載有細(xì)胞的生物墨水逐層打印。此過程不可避免地限制了打印量和細(xì)胞數(shù)。生物墨水的開發(fā)工作試圖通過改變墨水材料的化學(xué)和流變特性來增強(qiáng)細(xì)絲的自跨越能力，以實(shí)現(xiàn)體積增量。不幸的是，這種方法通常會損害細(xì)胞性能。為了克服這些限制，嵌入式打印(涉及在抵消重力和表面張力的支撐介質(zhì)中進(jìn)行3D打印)已被應(yīng)用于打印組織、軟機(jī)器人、生物傳感器和醫(yī)療設(shè)備。這種替代方法允許設(shè)計和構(gòu)建精的細(xì)體內(nèi)結(jié)構(gòu)(如脈管系統(tǒng)和空化)。除了設(shè)計自上而下的生物制造方法外，還必須正確選擇特定的細(xì)胞來源，以便再生目標(biāo)組織或器官。
將自上而下的嵌入式生物打印與自下而上的細(xì)胞自組織相結(jié)合的最新進(jìn)展導(dǎo)致了厚血管化組織的發(fā)展。血管化的心臟組織由于其固有的血管層次結(jié)構(gòu)而具有特別的興趣。盡管這些進(jìn)步代表了器官打印的重大進(jìn)展，但它們在體外和體內(nèi)同時維持細(xì)胞功能和復(fù)制組織結(jié)構(gòu)的能力有限，從而限制了它們作為移植替代品的潛力。此外，心臟和腸道等空心器官比肝和腎等實(shí)質(zhì)器官更容易構(gòu)建，因?yàn)閷?shí)質(zhì)器官執(zhí)行完整的生理功能，需要適當(dāng)?shù)募?xì)胞資源、完整的細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)整合和血管化。例如，肝細(xì)胞群由實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成。肝細(xì)胞約占總體肝臟細(xì)胞的70 %，并執(zhí)行肝臟的主要生理功能。由于肝臟的復(fù)雜性，肝臟3D打印的大多數(shù)研究都集中在用于術(shù)前可視化的脫細(xì)胞手術(shù)模型重建上。在3D自組裝的微型肝臟中發(fā)現(xiàn)其延長了小鼠肝衰竭模型的存活率。這項研究推進(jìn)了3D肝組織作為肝臟疾病的治療選擇。
在這項研究中，旨在使用自組織肝細(xì)胞構(gòu)建塊通過嵌入式生物打印構(gòu)建三維、功能性和可移植的肝球狀體封裝人工肝臟(HEALs)。嵌入式打印程序包括兩個步驟：在支撐物內(nèi)擠出油墨以形成設(shè)計結(jié)構(gòu)，然后去除支撐介質(zhì)以保持所需的結(jié)構(gòu)。去除步驟通常很難在不破壞打印結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行，尤其是當(dāng)打印件具有精細(xì)的脈管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)時。為了實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的器官打印，開發(fā)了一種基于疏水相互作用的聚合物網(wǎng)絡(luò)作為支持介質(zhì)。提出的支持介質(zhì)稱為全向打印嵌入式網(wǎng)絡(luò)(OPEN)，其主要特點(diǎn)包括：制備簡單、直接去除支撐物以及與不同生物墨水的兼容性，同時保持支撐穩(wěn)定性、精確打印能力和生物相容性(圖 1A)。然后將明膠-甲基丙烯酸酯(GelMA)與OPEN結(jié)合，以創(chuàng)建用于組織重建的載細(xì)胞打印件。使用原代小鼠肝細(xì)胞(PMH)作為肝功能重建的肝細(xì)胞組成部分，其來源培養(yǎng)基可以在體外誘導(dǎo)肝球狀體形成。為了創(chuàng)建載有細(xì)胞的靜脈結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)移植后血管形成，小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系C166作為靜脈生物墨水封裝在GelMA中(圖1B和C)。所得打印的肝臟稱為HEAL (圖1D)。每個HEAL層的打印路徑都是根據(jù)節(jié)段肝臟解剖結(jié)構(gòu)預(yù)先設(shè)計的，因此雙噴嘴打印可以相應(yīng)地準(zhǔn)確地重建肝臟段和靜脈(圖1E)。在體外證明了功能性肝細(xì)胞球體的形成以及標(biāo)志物蛋白表達(dá)和肝功能。此外，與傳統(tǒng)肝細(xì)胞培養(yǎng)物相比，打印的肝球體的基因表達(dá)與新鮮分離的PMH表現(xiàn)出更好的相似性，這意味著在原位肝移植中使用HEAL的潛力更高。我們還證明HEALs是可移植的，并且可以通過募集內(nèi)皮細(xì)胞和生長因子顯著誘導(dǎo)內(nèi)源性新生血管形成。
二、實(shí)驗(yàn)方法
2.1 嵌入網(wǎng)絡(luò)、洗滌劑和油墨制備為了產(chǎn)生OPEN，將12.5 wt% Pluronic® F-127(PF127，Sigma-Aldrich)在4 °C下溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中過夜，直至完全溶解。將2.5 wt%疏水改性羥丙基甲基纖維素(H-HPMC)(Sangelose 90L，Daido Chemical Co.)逐漸加入液體PF127中，并在冰浴中劇烈攪拌。將混合物移到50 mL錐形管中，并以大約1000 rpm 的速度離心1分鐘以去除氣泡。混合物被小心地轉(zhuǎn)移到丙烯酸盒中作為打印室。將 α-環(huán)糊精(a-CD)粉末在PBS中劇烈攪拌下溶解，作為配對的聚合物去除材料。對于OPEN中的生物打印，在混合或進(jìn)一步使用之前，通過0.22 μm過濾器對12.5 wt% PF127溶液和5 wt% a-CD溶液進(jìn)行滅菌。2.5 wt% H-HPMC 粉末和丙烯酸盒在紫外線(UV)下照射過夜。向凍干的GelMA聚合物(SunP Gel G1，SunP Biotech Co.)中加入無菌鹽水制備12.5 wt% GelMA，并將其置于70 °C水浴中直至完全溶解。液化的GelMA通過0.22 μm過濾器進(jìn)行滅菌，然后分裝到Eppendorf 管中，在4 °C下儲存。
2.2 流變測量
OPEN 的流變學(xué)特性是在旋轉(zhuǎn)流變儀(Discovery HR-2、TA儀器)上使用50 μm間隙和直徑為40 mm的平行板獲得的。將樣品轉(zhuǎn)移到測試板上，以2 °C/min的速度從0 °C加熱到40 °C進(jìn)行溫度掃描，以研究存儲和損耗模量行為隨溫度的變化。進(jìn)行穩(wěn)態(tài)剪切速率掃描，以測量聚合物網(wǎng)絡(luò)在0.01至1000 s?1不同剪切速率下的粘度和屈服應(yīng)力。為了測量自愈能力，進(jìn)行了階梯應(yīng)變測量。對樣品施加高應(yīng)變量（200%）30秒，然后 30 °C 下反復(fù)施加低應(yīng)變量（1%）相同的時間。通過添加 a-CD 添加劑后粘度下降來評估清洗劑的去除能力，隨后進(jìn)行穩(wěn)定的剪切速率掃描，掃描范圍0.1至1000 s?1。
三、結(jié)果
3.1 全向打印嵌入式網(wǎng)絡(luò)(OPEN)的設(shè)計和制造現(xiàn)有的支持介質(zhì)有兩種類型：顆粒狀凝膠介質(zhì)或散裝凝膠介質(zhì)。前者的典型例子是明膠顆粒或Carbopol，它們受到制造復(fù)雜性、工作溫度窗口和離子敏感性的限制。散裝凝膠培養(yǎng)基雖然易于制備，但由于難以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的粘度而難以去除，而這是從構(gòu)建體中成功去除支持介質(zhì)所必需的。為了將散裝凝膠培養(yǎng)基的易打印性和顆粒狀凝膠培養(yǎng)基的易去除性相結(jié)合，設(shè)計了一種基于疏水相互作用的支持培養(yǎng)基。這種OPEN 是通過在一步混合過程中將兩種FDA批準(zhǔn)的市售材料組合而成的。使用的材料是H-HPMC和PF127(圖2A-i)。單獨(dú)的Pluronic二嵌段共聚物不能作為自由形式書寫的支撐材料，因?yàn)?PF127膠束糾纏網(wǎng)絡(luò)是一種不可恢復(fù)的水凝膠，在噴嘴移動后會導(dǎo)致裂縫形成。此外，由于 PF127在非纏結(jié)膠束或單聚體狀態(tài)下以液體為主的特性，打印到PF127懸浮液中的結(jié)構(gòu)會下垂。為了克服單獨(dú)使用PF127的局限性，假設(shè)PF127非纏結(jié)膠束懸浮液可以與疏水性聚合物一起形成一個支撐和可恢復(fù)的網(wǎng)絡(luò)，用于通過物理交聯(lián)進(jìn)行全向3D打印。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，選擇了具有生物相容性H-HPMC，因?yàn)樵诘虷-HPMC濃度下，高密度的疏水部分促進(jìn)了PF127膠束的疏水核心與H-HPMC羥丙基末端的疏水硬脂基之間的物理相互作用(圖2A-ii)。在優(yōu)化了H-HPMC和PF127的成分比例后，確定了a-CD(也獲得了FDA批準(zhǔn))可作為一種有效的去除劑。a-CD應(yīng)用于OPEN聚合物網(wǎng)絡(luò)，通過a-CD(主體)的疏水內(nèi)腔和H-HPMC(客體)的疏水硬脂酰基之間的客體-宿主相互作用，迅速降低網(wǎng)絡(luò)粘度。單獨(dú)的a-CD結(jié)構(gòu)類似于一個空心錐體，內(nèi)部疏水，外部親水。當(dāng)H-HPMC存在時，大多數(shù)側(cè)鏈被a-CD的疏水內(nèi)表面包裹，形成輪烷絡(luò)合物。這種復(fù)合物破壞了H-HPMC側(cè)鏈之間的疏水相互作用，從而破壞了整個OPEN凝膠，導(dǎo)致OPEN的粘度降低(圖2A-iii)。
通過調(diào)整Pluronic和H-HPMC的重量百分比優(yōu)化OPEN的流變特性，以最大限度地提高其支撐能力。考慮到H-HPMC本身的溶解度極限約為3wt%，對OPEN凝膠進(jìn)行溫度掃描，從15wt% Pluronic開始，這是失去非纏結(jié)膠束結(jié)構(gòu)之前的最大濃度，以及2.5wt% H-HPMC。基于12.5wt% Pluronic的OPEN 凝膠在從室溫到體溫的所需溫度窗口內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定的固體特性和可調(diào)模量，適用于生物打印(圖2B)。其他組合物，如5wt%和10wt% Pluronic，顯示出以流體為主的特性，而15wt% Pluronic 表現(xiàn)出低模量可調(diào)性。接下來，通過測量凝膠屈服應(yīng)力和可恢復(fù)性來表征基于12.5wt% Pluronic的OPEN凝膠中的網(wǎng)絡(luò)形成。隨著 H-HPMC 濃度的增加(即更多的疏水部分)，觀察到更高的屈服應(yīng)力和粘度，證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)內(nèi)更強(qiáng)的疏水結(jié)合。1.5wt%和2.5wt% H-HPMC 凝膠在100 Pa下均顯示出屈服應(yīng)力值(圖2C)。為了研究OPEN凝膠的自愈性，應(yīng)用高應(yīng)變幅度(200%)來破壞網(wǎng)絡(luò)形成，然后立即恢復(fù)1%的應(yīng)變(圖2D)。這兩種凝膠濃度在幾秒鐘內(nèi)表現(xiàn)出相似的自恢復(fù)特性。然而，具有較高H-HPMC比率的網(wǎng)絡(luò)在破壞和重組循環(huán)中表現(xiàn)出更好的儲能模量恢復(fù)。因此，根據(jù)其打印溫度窗口、支撐能力和自我恢復(fù)能力，確定12.5wt% Pluronic加2.5wt% H-HPMC是OPEN制備的最佳組合物。有著支撐穩(wěn)定性、印刷精度和與各種交聯(lián)策略的兼容性。
在本文中，旨在探索凝膠網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)部形態(tài)，以闡述其支持機(jī)制。為了探索與網(wǎng)絡(luò)形成相關(guān)的疏水相互作用，檢查了OPEN的微觀結(jié)構(gòu)。SEM圖像顯示，OPEN凝膠自組裝成平均直徑小于20μm的孔幾乎均勻分布的結(jié)構(gòu)(圖2E )。然而，用低濃度Pluronic或H-HPMC制備的OPEN 凝膠無法組裝多孔網(wǎng)絡(luò)并表現(xiàn)出無定形形態(tài)。在12wt% 基于Pluronic的OPEN中，將H-HPMC的濃度略微降低至1.5wt%，將產(chǎn)生孔徑的異質(zhì)分布，與最佳OPEN 組成相比，這導(dǎo)致較低的屈服應(yīng)力和恢復(fù)能力。ESEM還證實(shí)，在其水合狀態(tài)下的大多數(shù)網(wǎng)絡(luò)孔徑小于20m。H-HPMC纖維的高度互連性質(zhì)也得到了可視化。為了了解OPEN的形成和自愈機(jī)制，還通過TEM研究了H-HPMC纖維的多級分子結(jié)構(gòu)。H-HPMC微原纖維在納米尺度上表現(xiàn)出柔韌和高縱橫比的細(xì)絲。PF127膠束的微觀結(jié)構(gòu)在文獻(xiàn)中已經(jīng)得到了很好的研究，它們是直徑約為20nm的高度均勻的球體。作為PF127球形膠束和H-HPMC原纖維聚合物的水凝膠混合物，假設(shè)PF127膠束的疏水片段與H-HPMC微原纖維的疏水側(cè)鏈之間的非共價相互作用調(diào)節(jié)了自組裝和剪切稀化性能。膠束和原纖維之間的典型相互作用在 TEM圖像中顯示，H-HPMC微原纖維組裝在隨機(jī)分布的PF127膠束上(圖2F)。在打印過程中，由于噴嘴引起的剪切應(yīng)力超過了OPEN的屈服應(yīng)力，因此噴嘴切斷了多孔OPEN凝膠。同時，生物墨水沉積在裂縫中。由于PF127膠束與H-HPMC的硬脂基之間的瞬態(tài)和可逆相互作用，剪切應(yīng)力去除后發(fā)生了快速的自愈過程。此外，由于OPEN專為生物打印而設(shè)計，通過細(xì)胞接種評估了OPEN的生物相容性。細(xì)胞保持活力(>97%)至少6小時，這比打印過程要長(圖2G)。
此外，3-5wt% a-CD添加劑的有效減薄行為(圖2H和i)，表明一旦打印完成，OPEN就很容易去除。溶劑的過度稀釋通常用作其他支持介質(zhì)的常見去除方法，但不能有效降低OPEN的粘度。當(dāng)存在a-CD時，OPEN構(gòu)建體的粘度急劇下降，而不是添加更多溶劑時，這表明OPEN去除是特異性的、可控的，并且只能通過H-HPMC和a-CD之間的疏水反轉(zhuǎn)發(fā)生(圖2H和ii)。驗(yàn)證了a-CD破壞多孔OPEN凝膠的能力，從而通過對洗滌后分解的網(wǎng)絡(luò)和剩余的部分孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像來導(dǎo)致OPEN變薄(圖2I)。
2. HEAL 的設(shè)計和打印
要使用OPEN建立器官或組織打印的通用打印方案，必須首先確定兼容的生物墨水。GelMA是一種廣泛采用的可光交聯(lián)膠原蛋白樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，常用于生物打印。光交聯(lián)生物墨水特別有用，因?yàn)樗恍枰囟ǖ慕宦?lián)條件，也不需要生物墨水中存在額外的交聯(lián)劑。使用GelMA和OPEN，我們確定了打印具有靜脈結(jié)構(gòu)的功能器官的最佳方法。由于需要肝移植替代方案，針對3D打印的HEAL進(jìn)行了優(yōu)化。使用GelMA/OPEN具有額外肝臟結(jié)構(gòu)的肝臟生物打印也被認(rèn)為極大地促進(jìn)了生物工程移植的潛在應(yīng)用。為了設(shè)計導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)的打印路徑，采用了Couinaud的人類肝臟節(jié)段解剖結(jié)構(gòu)作為肝靜脈設(shè)計的指導(dǎo)，包括肝靜脈和主門靜脈。由于在沒有灌注脈管系統(tǒng)的情況下體積限制和傳質(zhì)受限，在傳統(tǒng)打印中，厚組織或器官重建具有挑戰(zhàn)性。為了利用嵌入式打印提供的設(shè)計自由度，為肝臟分配了一個晶格打印通路，為脈管系統(tǒng)分配了一個循環(huán)打印通路。空間位格設(shè)計通過為每個單層交替沉積水平和垂直細(xì)絲來優(yōu)化氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。空間晶格設(shè)計還確保了打印件內(nèi)的等效細(xì)絲到細(xì)絲距離，由于重力限制，這在傳統(tǒng)打印中是不可能的。還可以控制打印參數(shù)，例如網(wǎng)格布局、網(wǎng)格密度和股線寬度，以為每個組織定制最終結(jié)構(gòu)。結(jié)合載有內(nèi)皮細(xì)胞的腎小管靜脈構(gòu)建體，打印了一個帶有主要靜脈系統(tǒng)的人工肝臟模型，用于進(jìn)一步的生物醫(yī)學(xué)評估。
3. HEAL 構(gòu)建體中小鼠肝細(xì)胞的生物相容性和活性
為了促進(jìn)HEAL構(gòu)建體內(nèi)細(xì)胞的肝功能，用特定的培養(yǎng)基培養(yǎng)打印的PMH，以便組裝成肝球體(圖3A)。首先在體外培養(yǎng)HEAL 21天，以研究PMH的活力。在體外觀察到10天后的高活力(>90%)和相對較高的活力(>80%) 2天(圖3B)。為了確定打印構(gòu)建體中的細(xì)胞活性，使用免疫熒光染色分析了肝球形態(tài)和肝標(biāo)志物蛋白表達(dá)。肝原纖維菌在培養(yǎng)10天后表現(xiàn)出較高的ALB和AA 熒光(圖3C和D)，表明肝功能。封裝的PMH在整個HEAL打印中自組織成球狀結(jié)構(gòu)，并獲得功能性肝細(xì)胞的特征多邊形形狀。肝球體還表達(dá)以下肝臟代謝標(biāo)志物蛋白，無需進(jìn)一步誘導(dǎo)：GST、MRP2和CYP 酶。
圖3. 封裝肝球體的體外表征。(A) PMH 在體外自組織成肝球體。(B)打印的PMH的活/死測定表明，在培養(yǎng)21天內(nèi)具有良好的存活率(>80%)。n≥6用于生物學(xué)重復(fù)。(C)成熟肝球體的共聚焦(z堆棧，左)和平面(右)圖像。比例尺= 100 μm。(D) GelMA生物墨水中肝球體的共聚焦z堆棧圖像。左和中：AAT(綠色)、ALB(紅色)和DAPI(藍(lán)色)。右：GST(紅色)、F-肌動蛋白(綠色)和DAPI(藍(lán)色)。比例尺= 20μm。(E)PAS 染色顯示的糖原儲存。比例尺，200μm。(F)通過Dil-ac-LDL 熒光染色測定的低密度脂蛋白攝取。比例尺，100μm。(G)6小時內(nèi)ICG攝取和釋放。比例尺= 100μm。(H)在10天的培養(yǎng)過程中通過qPCR 分析檢測到的肝臟標(biāo)志基因的表達(dá)。數(shù)據(jù)以SD±平均值表示。使用單因素方差分析確定統(tǒng)計顯著性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01，****P<0.005，;n=3個生物學(xué)重復(fù)。(I)12個樣品的主成分分析。每個點(diǎn)代表一個單獨(dú)的樣本。K-means聚類由點(diǎn)的顏色(k=4)表示。(J)熱圖顯示了PMH(n=3)、HEAL (n=3)、2D (n=3) 和3D(n=3)中肝臟發(fā)育/肝臟形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)的分層聚類。
在功能上，肝球體表現(xiàn)出成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志性能力。細(xì)胞將Dil-ac-LDL導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)中，并通過PAS染色呈陽性，證明糖原儲存能力(圖3E和F)。此外，ICG攝取和釋放試驗(yàn)揭示了細(xì)胞的功能狀態(tài)(圖 3G)。此外，10 日齡HEAL中存在中間層，表明移植前有功能性蛋白質(zhì)分泌。為了進(jìn)一步支持 HEAL 中的肝球表現(xiàn)出肝功能的觀點(diǎn)，除了分析形態(tài)和功能活性外，還使用qRT-PCR訪問了基本的肝臟特異性基因表達(dá)。假設(shè)HEAL中的PMH受益于空間晶格設(shè)計，因?yàn)橛捎诖_保均勻的絲到絲距離，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)可以自由擴(kuò)散到整個結(jié)構(gòu)中。為此，分析了兩組PMHs：(1) 2D培養(yǎng)中的PMHs和(2)在散裝或HEAL基質(zhì)中3D培養(yǎng)的PMHs。利用新鮮分離的PMHs的基因表達(dá)模式作為功能性肝細(xì)胞基因表達(dá)的對照組。對于在HEAL中培養(yǎng)10天的細(xì)胞，必需肝細(xì)胞特異性基因(如Alb和Aat)的表達(dá)水平是新鮮分離的PMHs的40%。其他肝臟標(biāo)志物基因，包括鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Fpn)、細(xì)胞角蛋白8 (Krt8)和細(xì)胞角蛋白18 (Krt18)，在HEAL構(gòu)建體中的表達(dá)水平顯著高于2D、大量3D甚至PMHs對照組。細(xì)胞色素P450、家族2、亞家族e、多肽1(Cyp2e1)和細(xì)胞色素P450、家族3、亞家族a、多肽11(Cyp3a11，人CYP3A4等效物)表達(dá)也觀察到類似的結(jié)果，表明細(xì)胞色素P450代謝在HEAL構(gòu)建體中。總的來說，這些結(jié)果表明，與2D和3D大量培養(yǎng)條件相比，HEAL中的肝球表現(xiàn)出更好的肝功能(圖3H)。為了系統(tǒng)評估HEAL中肝球體的基因表達(dá)譜，并詢問HEAL與2D、3D培養(yǎng)物之間的差異，進(jìn)行了大量mRNA測序。圖3J顯示了83個肝功能相關(guān)基因 (肝臟發(fā)育/GO：0001889 和肝臟形態(tài)發(fā)生/GO：0072576)的熱圖。HEAL的肝臟基因表達(dá)模式與新鮮分離的PMH 非常相似(圖3I和J)。值得注意的是，關(guān)鍵肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(如Jun、Cebpa、Cited2、Runx1和Otc)在新鮮分離的PMHs和HEAL中均高表達(dá)，但在2D或3D培養(yǎng)的PMHs中則不高。此外，對PMHs、HEAL和2D組進(jìn)行了差異基因分析，并從分析中生成了6個具有相似表達(dá)模式的簇。有趣的是，DEGs的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析揭示了多個肝臟和核糖體基因，這些基因在2D中下調(diào)，但在HEAL條件下恢復(fù)到正常水平。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，轉(zhuǎn)化控制和非酒精性脂肪肝病 (NAFLD) 相關(guān)途徑可能允許HEAL中的肝球維持肝功能。
4. 體內(nèi)HEAL 構(gòu)建體的新生血管化
由于通過HEAL構(gòu)建體的體外微型肝臟重建表現(xiàn)出肝臟結(jié)構(gòu)和功能，接下來評估了體內(nèi)構(gòu)建體的性能，以更好地了解其肝移植的潛力。將HEAL在體外培養(yǎng)2周，移植到小鼠體內(nèi)，并在體內(nèi)再放置2周(圖4A)。內(nèi)源性新生血管形成對于體內(nèi)肝細(xì)胞球體的維持至關(guān)重要，因?yàn)槊}管系統(tǒng)是氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)輸送所必需的，因此細(xì)胞功能和存活也是必要的。假設(shè)，與傳統(tǒng)打印相比，晶格設(shè)計中層和鏈之間保留的間隙可能有助于體內(nèi)血管生成。然而，單獨(dú)HEAL中的血管生成與傳統(tǒng)3D打印肝臟構(gòu)建體中的血管生成沒有顯著差異。為了解決這個問題，修改了HEAL打印設(shè)計，包括肝靜脈和門靜脈，并將C166細(xì)胞作為細(xì)胞構(gòu)建塊摻入靜脈打印中(圖4B)。將血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)應(yīng)用于載有C166的生物墨水上，以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
完全實(shí)現(xiàn)的HEAL顯示平均新血管密度增加10%，總血管長度增加60%，表明血管生成增強(qiáng)(圖4C、D、4E)。這種改善可能是由于打印的內(nèi)皮細(xì)胞和打印靜脈內(nèi)的VEGF的引入。雖然單獨(dú)的空間晶格設(shè)計不足以增強(qiáng)新生血管形成，但充滿內(nèi)皮細(xì)胞的靜脈和空間晶格設(shè)計的結(jié)合可能會協(xié)同作用，促進(jìn)體內(nèi)血管生成。具有陽性ALB、AAT染色以及熒光標(biāo)記血管網(wǎng)絡(luò)的顯微鏡圖像的疊加為功能性肝細(xì)胞和新血管共存提供了證據(jù)，表明該綜合方法有效地支持3D打印HEAL內(nèi)的肝細(xì)胞功能和血管生長(圖4F和G)。
值得注意的是，在打印靜脈的外表面觀察到內(nèi)源性新生血管形成。同時，打印的靜脈顯示出包埋細(xì)胞的襯里，表明包埋的內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)形成了匯合層(圖4H)。這一觀察結(jié)果表明，鑒于打印的靜脈位于 HEAL構(gòu)建體的中心，新血管廣泛滲透到移植的HEAL印記的內(nèi)部。由于打印的載有內(nèi)皮細(xì)胞的靜脈在移植后充當(dāng)血管生成的病灶，因此新血管能夠逐漸浸潤移植的HEAL內(nèi)部，從而增強(qiáng)對植入組織的營養(yǎng)和氧氣輸送。這種整合過程最終支持了植入物的功能和存活，這是成功移植生物工程組織和器官的關(guān)鍵方面。此外，空間晶格設(shè)計的采用，結(jié)合載有內(nèi)皮細(xì)胞的靜脈，可能會增強(qiáng)體內(nèi)血管生成，最終導(dǎo)致HEAL構(gòu)建體更有效的性能。利用IHC染色來可視化廣泛的血管形成，陽性CD31染色在體內(nèi)顯示內(nèi)源性血管生成(圖4I)。此外，IHC染色顯示HEEL在移植2周后保持了極好的肝功能(圖4I)。
實(shí)驗(yàn)討論
3D生物打印是一種有效的方法，可以創(chuàng)建具有仿生微環(huán)境的模型，這對藥物篩選和組織再生至關(guān)重要。在過去的十年中，使用臨床前模型對生物打印構(gòu)建體進(jìn)行植入和功能評估的研究顯著增加。然而，由于制造大型空心管狀結(jié)構(gòu)和心臟和腎臟等整個器官的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)生物打印產(chǎn)品的臨床轉(zhuǎn)化受到阻礙。這是因?yàn)楝F(xiàn)有的生物打印機(jī)無法復(fù)制天然微血管系統(tǒng)，并且由于引力而容易導(dǎo)致較大的結(jié)構(gòu)塌陷。嵌入式生物打印是一種新興的挑戰(zhàn)解決方案，因?yàn)檫@種新穎的凝膠-凝膠-方法使用機(jī)械弱或低粘度的生物墨水，通過減輕引力來生產(chǎn)大型和復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)。支撐槽的使用有助于打印多種復(fù)雜結(jié)構(gòu)，包括骨骼和心臟，并增強(qiáng)形狀保真度。肝臟是與人體至關(guān)重要而錯綜復(fù)雜的器官，具有合成和分泌、藥物代謝、血液凝固和免疫等多重功能。雖然肝移植是終末期肝病的實(shí)用解決方案，但其療效受到供體稀缺和免疫排斥的限制。肝組織再生工程已成為一種有前途的肝臟供體替代策略。先前的肝臟生物打印研究主要依賴于基于擠壓3D生物打印技術(shù)，使用明膠或藻酸鹽作為生物墨水，并生產(chǎn)出尺寸較小的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，通常為1cm×1cm，厚度為4層。使用脈管系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)大型器官水平肝臟生物打印仍然難以捉摸。鑒于這一限制，建議探索使用創(chuàng)新支持培養(yǎng)基OPEN打印具有靜脈結(jié)構(gòu)的微型肝臟并評估其肝功能和血管生成潛力的可行性。
首先定制了基于OPEN和GelMA組合的生物制造方案，GelMA是一種一次性形成的細(xì)胞外基質(zhì)(圖1B和C)。根據(jù)節(jié)段性肝臟解剖結(jié)構(gòu)設(shè)計打印路徑，并使用嵌入GelMA墨水中的活細(xì)胞打印這些結(jié)構(gòu)(圖1D)。代表性的PMH和C166細(xì)胞被用作封裝的細(xì)胞構(gòu)建塊，在體外重建具有靜脈結(jié)構(gòu)的生物功能HEAL(圖1E)。在HEAL中，PMH在體外自組織成肝細(xì)胞球體，表達(dá)多種肝臟標(biāo)志物，與傳統(tǒng)的2D或3D批量培養(yǎng)條件相比，肝功能和肝基因表達(dá)得到改善(圖3)。然后，將生物活性HEAL移植到小鼠體內(nèi)，并在體內(nèi)放置兩周(圖 2A)。肝球狀體包封的移植促進(jìn)了體內(nèi)成熟肝球狀體的內(nèi)源性新生血管形成并維持了成熟肝球狀體的標(biāo)志物蛋白表達(dá)(圖2B-H)。與沒有靜脈和常規(guī)網(wǎng)格打印的 HEAL 相比，帶有內(nèi)皮細(xì)胞的靜脈的 HEAL 移植促進(jìn)了體內(nèi)新生血管形成(圖2E)。因此有效地證明，OPEN作為一種新型支持培養(yǎng)基，能夠嵌入具有靜脈結(jié)構(gòu)的3D-HEAL生物打印，在體外表現(xiàn)出令人滿意的肝功能，在移植后體內(nèi)表現(xiàn)出血管生成潛力。
盡管在3D嵌入式生物打印構(gòu)建肝組織方面取得了研究成果，但仍然敏銳地意識到具有靜脈結(jié)構(gòu)的HEAL的結(jié)構(gòu)和功能與真正的肝臟還相去甚遠(yuǎn)。肝臟的復(fù)雜性包括一個高度復(fù)雜的解剖框架和多種生理功能，肝小葉是組成部分。這些小葉由門靜脈三聯(lián)征、肝細(xì)胞在毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)和中央靜脈之間呈線性線狀排列。除了肝細(xì)胞外，肝臟還隱藏著一個錯綜復(fù)雜的導(dǎo)管網(wǎng)絡(luò)，包括Glisson系統(tǒng)、肝靜脈系統(tǒng)和膽道系統(tǒng)。因此，雖然復(fù)制功能良好的肝球體和靜脈結(jié)構(gòu)勢在必行，但復(fù)制動脈結(jié)構(gòu)和膽管同樣重要但具有挑戰(zhàn)性。在探索肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用方面也有局限性，包括體內(nèi)和體外。沒有徹底研究生物材料特性和細(xì)胞空間排列的修改如何影響這些相互作用。此外，在細(xì)胞水平上，除了肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之外，膽管細(xì)胞、星狀細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞(如Kupffer)對于實(shí)現(xiàn)肝臟的全部功能是必不可少的。預(yù)計多細(xì)胞肝臟生物打印將取得進(jìn)一步進(jìn)展，從而更好地模擬肝臟微結(jié)構(gòu)和功能。這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)取決于生物打印技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)，包括多噴嘴聯(lián)動打印，以及能夠支持多種細(xì)胞類型生長和相互作用的生物墨水和多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的持續(xù)開發(fā)。
實(shí)驗(yàn)總結(jié)
開發(fā)了一種稱為OPEN的大塊凝膠支持介質(zhì)，將該介質(zhì)與兼容的生物墨水相結(jié)合，并創(chuàng)建了HEAL結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可在體外保留肝功能并在體內(nèi)促進(jìn)新血管形成。簡便的制備、簡單的去除方法以及將OPEN與不同的生物墨水和交聯(lián)方法輕松結(jié)合的便利性使OPEN成為組織或器官3D生物打印的有用工具。隨著人類細(xì)胞重編程和分化的不斷進(jìn)步，平臺提供了一種現(xiàn)成的途徑來設(shè)計具有多種細(xì)胞類型的打印結(jié)構(gòu)，以重現(xiàn)具有高度結(jié)構(gòu)和功能相似性的目標(biāo)組織或器官。設(shè)想OPEN將為個性化再生醫(yī)學(xué)鋪平道路，有朝一日可以作為器官功能替代手術(shù)中使用的可移植替代品。
參考文獻(xiàn)
Zhuoran Jiang, Bao Jin, Zhu Liang, Yinhan Wang, Shuai Ren, Yongfa Huang, Changcan Li, Hang Sun, Yunzhu Li, Li Liu, Nianlin Li, Jinzhuo Wang, Zhanfeng Cui, Pengyu Huang, Huayu Yang, Yilei Mao, Hua Ye,Liver bioprinting within a novel support medium with functionalized spheroids, hepatic vein structures, and enhanced post-transplantation vascularization, Biomaterials, Volume 311, 2024, 122681, ISSN 0142-9612,
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122681.